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    公开号:WO1991008296A1
    申请号:PCT/JP1990/001546
    申请日:1990-11-28
    公开日:1991-06-13
    发明作者:Keisuke Isomura；Yoshinori Matsumoto；Masaaki Chatani；Masato Ikegami
    申请人:Nippon Oil Co., Ltd.；
    IPC主号:C07K14-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書
    [0002] O R S V遺伝子の c D N A
    [0003] 技術分野
    [0004] 本発明は、 ォ ド ン ト グロ ッ サム リ ン グスポ ッ 卜 . ゥ イ ソレス ( Odontoglossum r ingspot virus ； O R S V ) の 遺伝子に対応する D N A及びその断片、 並びにそれらの 相補鎖に関する。
    [0005] 本発明は、 特にォ ド ン ト グロ ッ サム リ ン グスポ ッ ト ウ ィ ル ス の遺伝子.に対応する単離され又は ク ロ ー ン化さ れた環状ま たは線状の D N A及び及びその断片、 並びに それ らの相補鎖に関する。
    [0006] 本発明のォ ド ン 卜 グロ ッ サム リ ン グスポ ッ ト ウ イ ルス の遺伝子に対応する 及びその断片、 並びにそ れらの相補鎖は、 植物に使用 して有用 なベク ターを構築 する際の素材 と して有用であ り 、 更に ま たラ ン科植物の ' — ウ ィ ルス抵抗性株の作成に使用 されて有用である。
    [0007] ま た本発明のォ ド ン ト グロ ッ サム リ ングスポ ヅ ト ウ ィ ルスの遺伝子に対応する じ Λ/ Α及びその断片、 並び にそれ らの相補鎖は、 ウ ィ ルスの遺伝子をス ク リ ーニ ン グする 際のプロ ーブと し て有用である。
    [0008] 新たな用紙 更に ま た、 本発明の ォ ド ン ト グロ ッ サム リ ングスポ ッ ト ウ ィ ルス の遺伝子 に対応す る 及びその断 片.、 並びにそ'れらの相補鎖は、 それを適当な発現べク タ —に組込んで宿主細胞で発現する こ と によ り 、 ウ ィ ルス 関連タ ンパク質及びペプチ ドを製造する に使用でき、 更 にその ウ ィ ルス関連タ ンパク質及びペプチ ド は、 ウ イ ル ス及び ゥ ィ ルスの遺伝子をス ク リ 一ニ ングするための 試薬 と してある いはその ウ ィ ルス及びウ ィ ルスの遺伝子 をス ク リ ーニ ン グする ための試薬作成のための試薬と し て有用 である。
    [0009] 背景技術
    [0010] ォ ド ン ト グロ ッ サム リ ングスポ ッ ト ゥ ィ ル ス ( Odontogl ossum ringspo t virus； 0 R S V ) は、 カ ト レア、 シ ン ビジ ゥ ム、 デン ド ロ ピウ ム、 ォ ド ン ト グロ ヅ サムな どのラ ン科植物に主に感染する棒状の R N A ウ イ ルスであ り 、 ウ ィ ルス粒子自体はすでに単離されている (農学研究、 Vol.6 0 、 Nov. 2 、 5 3 - 6 7 、 1983) 。
    [0011] しかし乍らその遺伝子その ものは単離されてお らずそ の遺伝子の塩基配列をは じめ遺伝子の構造に関する情報 新たな用紙 は全く知られていない。 従って、 その遣伝子を利用するこ とは全く不可能であった。
    [0012] 一般に、 ゥィルスからの 遺伝子は遺伝子組換え技 術において、 動物分野を中心に広くベクターとして開発利 用されている。 しかし、 植物の場合その植物ウィルスの大 半はその遺伝子として をもつものであり、 すぐさま その植物ウィルスの遣伝子 を遣伝子組換えに用いる ことは技術上困難である。 そこでその Λ を鏡型にして c 2 ^ に置き換える必要がある。
    [0013] 現在までに植物遺伝子組換え用ベクターとしての利用の 可能性のあるものとして知られているのは、 例えばトマト やタバコなどの双子葉類植物に腫瘍を作るァグロパクテリ ゥム · ッメファシエンス Agrobac t erinm t mefa- ciens )が有している核外遣伝子め プラスミ ド、 キ ャべッや白菜などに病気を起こす力リフラヮーモザィク ウィルスからの！) 遺伝子などである。
    [0014] 植物ウィ ルスは殆どすべてが ウィ ルスであり、 し かもその増殖能は極めて髙くて、 タバコ モザイク ウイ ルスなどではグラム単位のゥィルスを得ることも容易であ る。 このことから植物細胞が の複製に適した何らか の生理的条件を傭えていることが考えられる。
    [0015] したがって、 ウィルスを用いた ベクタ一系 は植物では極めて有用であると思われる。 し力 し、 従来植 物に対するベクターといえば： Ti プラスミ ドと同義と思わ れるぐらい、 それ以外に有用なベクターが存在していな力 つたが、 Ti プラスミ ドは植物細胞の染色体に組み込まれ るため、 その発現量は極めて低いという問題がある。 一方
    [0016] ウィルスにより構築された iv ベクターは、 染色 体とは独立して自己増殖するベクターであり、 それからの 発現量は プラスミ ドを用いた場合よりも遙かに髙^ とが期待される。
    [0017] T i プラスミ ドによる外来退伝子の導入は、 以上のよう なことからもっぱら植物育稳'という視点からのみ論じられ、 農薬耐性遺伝子の導入などがその話題の中心となってき Λ o しかし、 自己複製能をもった植物の新しいベクターとして の ベクターの導入は、 動物ホルモンなどの有用タン パク質を生産する場としての植物細胞または植物体を見直 すことになる。.
    [0018] また、 大腸菌を用いた有用タンパク質の生産は実用段階 に入って多くの困難に直面している。 その一つは、 外来タ ンパク質の発現量が大きいと封入体としてその発現タンパ ク質が閉じ込められてしまうことがあることである。 大腸 菌は一個の細胞で生命を維持しているので、 大量の異物タ ンパク質が生産されると、 そのことは大暢菌にとつて好ま しくない らである。 従って、 できるだけその影饗を除く ためにその発現タンパク質を封入体に閉じ込めてしまうこ とは大腸菌にとっては非常に合目的であるのである。 この ため大腸菌を宿主とした物質生産を考える場合、 これは避 けて通れないデメリットてある。
    [0019] これに反し、 植物体は大きな寛容性をもっている。 例え ば、 一つの葉が枯れてしまったとしても植物体全体への影 響はそれほど大きくない。 このような植物の性質を考える と異種タンパク質が多量に生産されても、 変成不溶化させ るような強力な排除機構は働かない。
    [0020] それゆえに、 ォドントグロッサム リングスポッ ト ゥ ィルスの遣伝子に対応する c JDNAを RNAベクターとする ことは、 それ自体極めて意味のあることである。 また、 こ の c D V の中にはウィルスの外被タンパク質遺伝子が含 まれており、 これを プラスミ ドに連結し植物細胞の染 色体に組み込むことによりウイルス抵抗性品種の作出が期 待しうる。 ォドントグロッサム リ ンク，スポッ ト ウ ルスの BNA 遺伝子を単離することに成功すると共に、 その单離された 遺伝子を鏡型としてそれに相補的な i cDNA ) を作製し、 さらにそれをクローニングし、 次にそのクロ一 ニングされた c を使用してォドントグロッサム リ ングスポッ ト ウィルスの遺伝子を発現することに成功し た。 さらにその c には適当な制限酵素切断部位があ ることも見出した。
    [0021] そして、 そのクロー-ングされた c ) をもとにォド ントグロッサム リングスポッ ト ウィルスの遺伝子に対 応する c ^の塩基配列を決定し、 その塩基配列から得 られる知見を利用するとともに、 遺伝子組換え技術等を利 用して新しいベクター及び形質転換体の作出、 あるいはゥ ィルスなどの検知がなしうることを見出した。
    [0022] 発明の開示
    [0023] 本発明は、 ラン科に属するカトレア、 シンビジゥム、 デ ンドロ ビゥ厶、 ォドントグロッサム等から、 特に単離され るォドントグロッサム リ ンク'スポッ ト ウィルスの遣伝 子に対応する ^ ^!及びその断片、 並びにそれらの相補鎖 に関する。
    [0024] 本発明で意図するォドントグロッサム リングスポット ゥィルスは必ずしもラン科植物のみから単離されるものに 限らず、 以下に詳述するような理由からそのウィルスとし ての特性を有するものであれば、 そのすベてを含みうるこ とができる。
    [0025] 本発明に係わるォドントグロッサム リングスボット ウィルスは、 その感染性に重大な影響を受けないで天然に 変異することが可能であり、 また人工的にも適当なニトロ ソゥレア等の変異剤の処埋あるいは紫外線又は放射線の処 理により、 変異させることができる。
    [0026] 更に、 本発明によって開示されているその塩基配タ ϋにつ いての情報を利用して、 そのウイルスの遺伝子の—部を置 換したり、 削除したり、 あるいは忖加したり、 あるいは、 他のウィルス、 細菌、 動植物の遺伝子を加えたりすること ができ、 そのようなもののうちには、 依然としてォドント グロッサム リ ングスポッ ト ウィルス様の性質を保持す ることができるものがあり祷るのである。
    [0027] 本発明のォドントグロッサム リ ングスポッ ト ウィル スの'遺伝子に対応する は、 代表的には図 1に示され る塩基 列を有する二本鎖 のうちの任意の一部ある いは全部を有するものである。 図 1に示された配タ ϋのうち、 上段に記 の配列がォドン トグロッサム リグンスポット ウィルスのゲノムの +鎖 に対応する c ^ 鎖であ る 。
    [0028] ま た、 こ の よ う な D N Aの う ちには、 ォ ド ン ト グロ ッ サム リ ン グスポ ッ ト ウ ィ ルス遺伝子の う ちの 3 3 K タ ンパ ク質あるいは外被 （ コー ト ） タ ンパ ク質の遺伝子 のいずれかある いは両方を含むものが挙げられる。 更に 本発明は上記二本鎖 D N Aの う ち単に ウ ィ ルス R N A に 相補的な D N A鎖のみでな く 、 も う一方の D N A鎖を も 包含する ものである
    [0029] 更に ま た、 本発明は、 図 1 で示される D N Aの塩基配 列の う ちの任意の一部か ら な る D N A 断片を も包含す る。 こ の よ う な D N A断片は、 適当な公知の制限酵素を 単独である いはその複数個を組み合わせて用いる こ と に よ り 第 1 図で示される塩基配列を有する D N Aから誘導 される ものである
    [0030] で使用できる制限酵素と しては例えば蛋白質 · 核
    [0031] 新たな用紙 酸 ·酵素 し 30 /ί 13 , p. 1 4 29 - 1 4 4 5
    [0032] ( 1 9 8 5 )に示されているようなものなどを挙げること ができる。 さらに、 例えばこのような 断片としては、 図 1て示される塩基配列を有する ^を、 制限酵素 C α
    [0033] Iで処理し、 2ケ所を開裂させ、 そうして得られる約 3.87
    [0034] Kbpの 斷片、 約 1.5 8 δρの 断片及び約 0.56 も ρの £> 断片であってよい。 また別の例としては、 図
    [0035] 2に示したようにして各種制限酵素を作用させて得られる ものがあげられる。
    [0036] このように図 1て示される塩基配列を有する に適 当な制限酵素を作用させて得られる 断片は、 その制 限酵素が有する認識部位の特異性と、 図 1で示される塩基 配列とからいかなる配列を有するものであるかは明らかで ある。 さらに本発明は、 このようにして得られた ^ 断 片に、 化学的な方法で塩基を付加したり、 除去したりした もの及び化学的な方法で合成された ) 断片を付加した ものをも包含している。 すなわち、 上記したようにして得 られた 断片をェキソヌクレアーゼにより短縮化した り、 あるいは種々の 断片にオリゴヌクレオチド又は ポリヌクレオチドを付加することにより延長したりしたも のをも包含している。
    [0037] 本発明はさらに図 1に示された塩基配列の任意の一部あ るいは全部の/) ^ 鎖のいずれかをプローブとして用いて、 それに対してハイプリダイズする遣伝子をも包含するもの である。
    [0038] このような遗伝子としては、 実質的にォドントグロッサ ム リングスポット ウィルス遣伝子中の全あるいは各遺 伝子と向一あるいは類似の機能を有するものがあげられ、 さらにその遺伝子に対応する c 又はその断片、 ある いはそれらの相補鎖 ) であってよいものである n 本発明のォドントグロッサム リ ングスポッ ト ウィ ル スの遺伝子に対応する は、 本ウィルスの感染を受け た植物体^らそのウィルス粒子を単離し、 次にそのウィル ス粒子からウィルス を分離し、 次にそのウィルス
    [0039] R N Aを錡型にして逆転写酵素を作用させることにより得 ることができる。 次にこのようにして得られた は、 適当なク口一ニングぺクターに組み込まれて適当な宿主中 に導入されて増すことができる。 このようにして得られた クローニング！) ^ は、 それを適当な制限酵素を使用して 断片化した後、 マキサムギルパート法とかあるいはチエイ ンターミネーシヨン法等の方法でその塩基配列を解析する ことができる。
    [0040] このようにして一旦解明されたその の塩基配列は、 その知見を利用してその任意の一部又は全部の塩基配列を 持つ/) を調製しそれをプローブとして用いて、 天然に 存在する遗伝子から得られる遺伝子ライブラリ一あるいは ショッ トガン遺伝子ライブラリーを検索して、 新たな突 的に才ドン トグロッサム リ ングスポッ ト ウィルスの機 能を有する あるいはそれに対応する c ^ などを 容易に取得できる。
    [0041] したがって、 本発明は、 ォドン トグロッサム リ ングス ポット ウィルス遺伝子、 又はその対応 、 さらに はそれらの核酸断片を検知するための分析法をも提供する c また、 本発明は、 このようにして検知されたォドントグ ロッサム リ ングスポッ ト ウィルス遣伝子に対応する 又はその断片あるいはそれらの相補鎖 2 ^ [をクロ 一 ングする方法及び、 そうして得られた 又はその 断片あるいはそれらの相補鎖^ ^[にも関する。
    [0042] 本発明は、 またォドントグロッサム リ ングスポッ ト ウィルスの遺伝子に対応する^ ^ [又はその断片、 あるい はそれらの相補鎖を組み込んでなる逍伝子組換えベクター にも関する。
    [0043] 本発明は、 さらに図 1で示される塩基配列を有する二本 鎖 のうちの任意の一部ある 、は全部を含有する DNA 及びその断片、 並びにそれらの相補鎖を組み込んでなる遺 伝子組換えベクターに関する。
    [0044] 本発明の遺伝子組換えベクターは前記本発明のォドント グロッサム リ ングスポッ ト ウィルスの遺伝子に対応す る 2) ^ ^又はその断片あるいはそれらの相補鎖を、 当業者 に広く知られていたり、 当業界において広く使用せられて いたり、 あるいは市販されており、 容易に入手することの できる他の生物の基本的なベクターの単独あるいはそれら から適当に調製されたベクターに組み換えて得られるハイ プリッド であることができる。
    [0045] このような他の生物の基本的なベクタ一としては、 例え ば大腸菌プラスミ ドベクター、 コスミ ドベクター、 ファー ジベクター、 枯草菌用プラスミ ドベクタ一、 スタフイロコ ッカス由来のプラスミ ドベクター、 酵母用ベクター、 複数 の宿主細胞において自律増殖てきるシャトルベクターなど をあげることができる。 これらベクターは適当なプロモー ター、 制限酵素切断部位、 選別用のマーカーを持つが、 適 宜それに必要な機能をさらに加えたものであってもよい。 ここでこの大腸菌プラスミ ドベクターとしては、 例えば、 pBR 3 2 2、 pBR 3 2 5、 pBR 3 2 8, φϋ C 9, p C 1 1 8. pUC 1 1 9¾ φΜΒ 9、 pKC 7 などをあ げることができ、 さらにこのコスミ ドベクターとしては、 例えば 2 6 6 2、 pJ C7 9、 p 7 2 0 などがあ げられる。 .
    [0046] 上記ファージベクターとしては、 例えばス 11、ス 0ί· ス C、 Xg t · λΒ ス 1 05 9- £Μ β L 3.4、 WES · シャロン 4 、 シヤロン 2 8、 ス L 4 7— 1、 シャ ロン 8、 シヤロン 1 7、 シヤロン 2 0、 シヤロン 3 、 シ ヤロン 1 6 、 シヤロン 1 3 、 シヤロン 1 4 、 シャロ ン 1 5 などがあげられる。
    [0047] またこの枯草菌用プラスミ ドベクターとしては、 例えば， φϋΒΐ 10, φϋΒΐ Ι 2, φΒΥ 3 O OPLK ρΤΛ 060, ρΓ 015、 020、 pT 050、 φΤ Ρ 4,
    [0048] J55などがあげられる。
    [0049] さらに、 スタフイ ロコッカス由来のフ。ラスミ ドベクター としては、 例えば、 p<S 0501、 pC l 94. pC221、 ？) C223、 φϋΒΐ 10, ρひ 112、などがあげられる。 上記酵母用ベクターとしては、 例えば、 ？7、 Yi p 32、 YEp 13. pY l^ pYC2, Y Ip l, p DB 2 4 8、 DB2 1 9 , j)J D£24 S, φΏΒ2 8,pGK 一 l,2、 p C5 4 4、 pFYM2, φ F Y M 2 2 5などの 型ベクター、 y p型ベクター、 ベクター、 y e p型プラスミ ドベクター y ^i p型べクタ一などからえ らぶことができる。
    [0050] さらにまたこのシャトルベクターとしては、 例えば、 p FYM 2 2 5、 Y R p 7、 Υ Ι φ 5 由来プラスミ ド、 ρ丁 1 3 0 2、 あるいは上記ベクターのうち、 複数の宿主域を 有するもの、 さらには新しく制限酵素などを用いて適当な プロモーター、 その他の制御配列などを組み込んだり、 あ る 、は； 1 、のべクタ一を組み合わせたものなどがあげられ これら本発明のハイブリッド は、 本発明の第 1図 で示される塩基配列を有する二本鎖 を、 好ましくは 適当な 1ケ所あるいは複数ケ所で切断しうる制限酵素で処 理した後、 これを同一の制限酵素て開裂させた上記他の生 物の基本的なベクターに組み込むことにより製造できる。 また、 本発明のハイブリッド は、 例えば^製した ウィルスより抽出した. を銹型にして得られた
    [0051] を、 D 結合酵素、 例えば： 4 > ^ リガーゼによ り 処理してその両端に fco Iアダプターを取り付け、 次に これを上記他の生物の基本的なベクター、 例えば pひ C
    [0052] 1 1 8を EcoR I分解後アル力リホスファターゼ処理した ものと混合し、 次に 結合酵素、 例えば: 4 DNA リガーゼにより結合環化させることにより得ることができ ' 上記アルカリホスファターゼ処理は、 他の脱リン酸化酵 素処理で代用することも可能であり、 その処理は の
    [0053] 5' -末端の脱リン酸化をすることにより自己環化を防止す ' ることができて、 好ましいものである。
    [0054] なお、 この方法で使用できる制限酵素としては、 例えば
    [0055] EcoR l c ¾ Ps ί Hind ^ ^lu^ Xba ί、 ico./ V及び^) Iなどがあげられるが、 また IS白: 核酸 酵素 ，30 , ½1 3 , p.1425-1445 ( 1985 ) に記載されたものあるいはその他の公知のものが使用しう る o
    [0056] このようにして得られた本発明のハイプリ ド は、 それぞれ適当な宿主細胞に導入することができる。
    [0057] 例えば、 大腸菌プラスミ ドベクターとのハイブリッド j の場合は、 大腸菌に、 枯草菌用プラスミ ドベクター とのハイブリッド！> その場合には、 枯草菌に、 スタフィ 口コッカス由来のプラスミ ドベクターとのハイブリッド
    [0058] の場合にはスタフイ ロコッカス菌に、 酵母用べクタ 一とのハイブリッド/) の場合には酵母菌に、 そして更 に複数の宿主域を有するシャトルベクターとのハイブリッ ド^ ^ [の場合には適宜適当な宿主に、 公知の方法に従つ て導入することができる， こ の よ う なノイ ブ リ ッ ド D N Aの宿主への導入法 と し ては、 例えば大腸菌や枯草菌の場合は、 公知の方法を適 用 し て例えば、 C a. C 1 2処理によ り 宿主細胞を コ ン ビテ ン ト 細胞 と し た後に形質転換する。
    [0059] ま た、 酵母の場合には細胞壁溶解酵素、 例えばグルス ラ ーゼ、 ヘ リ 力 一ゼ、 ザィ モ リ アーゼ等で処理 し てプロ ト プラ ス 卜 ィヒし た後、 例えば、 P E G及び C a + + 存在下 に形質転換させた り 、 ある いはアルカ リ 金属イ オ ン、 例 えば L i +等、 又は還元剤、 例えば 2 — メ ルカ ブ ト ェタ ノ ール等で処理 し て形質転換させる方法があげられる。
    [0060] こ の よ う に して得られた形質転換体は適当な薬剤耐性 ある いは栄養要求性を利用 して選び出 された り 、 ある い は コ ロ ニーハイ プ リ ダイ ゼーシ ョ ン法を用 いて選び出す こ と 力 sでき る。
    [0061] 更に ま た本'発明のハイ ブ リ ッ ド D N Aは、 その う ち に
    [0062] 新た な用紙 更に他の外来遺伝子を組み込んでなるものであってもよい。 このような外来遺伝子の起源としてはウィルス、 植物、 動 物、 細菌、 菌類などの生物体あるいは、 化学合成したもの であってよい。
    [0063] 本発明において便用することのできる外来遗伝子として は、 また植物を形質転換させるのに使用しうるものが好ま しく、 そのようなものとしては、 害虫又は寄生虫に対する 耐性付与遺伝子、 病原体に対する耐性付与遣伝子、 除草剤 抵抗性あるいは耐性に関与する遣伝子、 その成長性に影饗 を与える遣伝子、 産業上有用なタンパク質又はペプチド、 あるいはその他の物質をその体内て産生させるための遺伝 子、 などがあげられる。
    [0064] ここで、 害虫又は寄生虫に対する耐性付与遣伝子として は、 毘虫又は線虫に対する殺虫性毒素産生遣伝子、 プロテ ィナーゼィ ンヒ ビター誘導遣伝子、 リボゾーム不活性化タ ンパク質産生遺伝子などがあげられる。
    [0065] 除草剤抵抗性あるいは耐性に関与する遣伝子としては、 ノ s、'ラコート耐性遣伝子、 スルフロン耐性遣伝子、 スルホナ ミ ド耐性遗伝子、 ダリホセート耐性遣伝子、 などがあげら れる。
    [0066] また病原体に対する耐性付与遺伝子としてはウィルス耐 性付与遺伝子、 各種細菌産生毒素に対する耐性付与遺伝子、 カナマイシン耐性などに関与する遺伝子などがあげられる。 また、 その成長性に影饗を与える遺伝子としては、 例え ば髙温、 低瘟、 水不足あるいは肥科又は栄養素に対する改 良された耐性を付与するような遺伝子があげられる。
    [0067] さらにまた植物で通常見出される酵素、 貯蔵タンパク質 などを制御している遣伝子があげられる。 また、 その他植 物に導入されて有用あるとされる遺伝子をあげることがで きる。 本発明のハイブリッド を用いての形質転換方法に ついて、 さらに一つの具体例をあげて詳しく説明する。
    [0068] 例えば本発明のハイブリッド が、 第 1図の" V の両端に ^co Iアダプターを: 4 DNA リガーゼによ り結合したものと、 大腸菌プラスミ ドの pひ C 1 1 8の
    [0069] co I分解物とを、 T4 リガーゼで結合したハイ ブリツド ^[である場合、 このハイブリッド でも つて公知の方法により、 大腸菌 J M 1 09株を形質転換し、 次にアンピシリン 5 （ 2 X の表面に l O O lf 及び 2 — gtii を含 む）のうえに生じたコ口-一に対し、 ブルーホワイ ドセレ クシヨン法（ ！αο- 2遣伝子の発現の有無による選抜法） を施こして白色のコロニーのみを選別する。
    [0070] のようにして得られたコ ロニーは、 プラスミ ド ρひ C 8の oR I部位に第 1図で示されるような塩基配列 を有する が挿入されたハイプリッド で形質転 換された大腸菌 1 0 9株である。 この形質転換体 ら 公知の方法によりハイプリッド" を分離することがで きる。
    [0071] なお、 ¾上のような手法を繰り返すことにより、 才ドン トグロッサム リ ングスポッ ト ウィルス遺伝子の全長に 対応する c D N Aの塩基配列を順次決定することも可能で める o
    [0072] このハイブリッド は、 それをそのままあるいは適 当な断片として下記に示すような植物細胞形質転換用のベ クタ一に組み込んでもよいし、 あるいはそれをそのま-まあ るいは適当な処理を加えた後新たにハイプリッ ΰ N Aを 作成して宿主細胞を再度形質転換したり、 あるいはその イブリッド D ^ を保有する形質転換体を増殖させて増や すこともできる。 例えば、 目的とするハイブリッド^ を大量に調製す るためには、 ハイブリッド ^ を含有する形質転換体、 例えば大腸菌 J ^ 1 0 9株を増殖させ、 さらには必要に応 じてハイプリッド のみを増幅させるような処理を加 え、 次にその菌体を溶菌させ、 得られたハイブリッド を含有する水溶液から超遠心法、 電気泳動法などの手段を 施こしてそのハイプリッド を分離しうる。
    [0073] 例えば、 ハイブリッド^ が大腸菌用のプラスミ ド pひ C 1 1 8とのハイブリッド である場合には、 該 ハイプリッド^ ^ ^[を含む大腸菌の形質転換体を公知の方 法に従ってハイプリッド ^ 増幅処理した後公知の方法 で溶菌し、 こうして得られた 含有溶液を、 セシウム クロライ ド平衡密度勾配遠心法を用いてコパレン トリーク ローズドサーキユラ一型のハイブリッド V のみを分離 ことにより行なうことができる。 さらにまた、 このようにして分離されたハイブリッド ΰ Ν は、 クローニンク'の際に使用したと同じ制限酵素で 処理することにより、 ォドントグロッサム リングスポッ ト ウィルスの遺伝子に対応する^ 又はその断片、 特 に図 1に示された塩基配列の任意の一部又は全部を有する
    [0074] 断片と、 ベクター J5 i とに分けることができる。 さらにまたこうして得られた/ 断片は、 ァガロースゲ ルあるいはポリアクリルァミ ドゲルなどを用いたゲル電気 泳動によって互いに分離し、 例えば当該 断片を含む パンド部分のゲルを切り取り、 公知の方法に従ってゲルよ り 断片を抽出するなどして分離し精製することによ り、 精製されたものを得ることができる。
    [0075] このようにして得られた は、 さらにまた発現用ハ イブリツド に組み換えて適当な宿主細胞に導入させ て発現させることができる。 本発明において 、 ォドントグロッサム リングスボッ ト ウィルス粒子を構成する 3 タンパク質及び外被タ ンパク質を宿主細胞中で発現させて取得することができる。
    [0076] - 本発明に従えば遣伝子組換えの手法を用いてそれらのタ ンパク質の一部の了ミノ酸配列からなるペプチドを取得す ることも、 あるいはその構成アミノ酸の一部を置換させた り、 付加したり、 欠失させることも容易に行なうことがで きることは当業者であれば容易に理解できよう。
    [0077] したがって、 本発明のォドントグロッサム リ ングスポ ット ウィルスの 3 3 タンパク質及び外被タンパク質、 更にはそれらの断片ペプチド化合物は、 それらすベてを包 含するものである。
    [0078] なお、 上記ォドントグロッサム リングスポッ ト ウイ ノレスの 3 3 タンパク質 ¾ 、 タバコモザイク ウイノレス C T M V ：)の 3 0 タンパク質と同様の機能を有するもの である。
    [0079] 本発明の遣伝子組換えベクターは、 前記本発明の才ドン トグロッサム リ ングスポッ ト ウィルスの遺伝子に対応 する 又はその断片あるいはそれらの相補鎖を、 当業 者に広く知られたり、 当業界において広く使用されていた り、 市販されており容易に入手することのできる植物細胞 あるいは植物組織を形質転換しうるベクタ一に組み換えて 得られるハイプリッド であることができる。
    [0080] このような植物細胞ある 、は植物組緻を形質転換しうる ベクタ一としては、 例えばグラム陰性菌のリゾビゥム科
    [0081] C kizobiacede) ァグロ ノ クテリ ウム属 ( Agrobac- t erium)に属するァグロバクテリ ウム ·ッメファシェン
    [0082] ( Ag robac t eri um t me f aci ens j およひァク ロ ノ クテリウム · リゾゲネス種 C Agrob ct eri
    [0083] rhizogenes) に保持され、 植物にクラウンゴール病及 び根毛病を引き起こす原因ブラ^ミ ドとして見出された i プラスミ ド又はそれから誘導されたプラスミ ド、 及び
    [0084] Ri プラスミ ド又はそれから誘導されたプラスミ ド、 力リ フラワーモザイクウィルス由来ベクター、 ジェミニウィル ス由来ベクター、 酵母用ベクターとして知られたシャトル ベクターなどがあげられ、 植物細胞内て自律複製できたり、 植物細胞の形質転換ができるものなどから選ばれて用いる ことができる。
    [0085] ここで特に プラスミ ド又はそれから誘導されたプラ スミ ドとしては、 そのォパインと総称される、 例えばォク トビン、 ノパリン、 ァグロピンによって分類される各プラ スミ ドがあげられ、 また - 領域を trプラスミ ド， あるいはその他のォピン分解、 発癌性、 ァグロシン感受性 などに関与する遺伝子の他、 その複製などに関与する遣伝 子を組み合わせて作成されたものがあげられる。 のようなプラスミ ドとしては、 p W O V系ベクター、 p G 3 8 5 0で代表されるような disarm型のア i プ ラスミ ド、 バイナリ一型ベクターなどがあげられる。
    [0086] このようなプラスミ ドの代表的なものとしては例えば 5. G .Ron ers e t a I .Re c o b inau t DN A me t kodo- logy ,Ray W% " ·編 · p 3 8 7— 41 0 (1989 ) Academic Press に示されている J) ひ 2 0 0、 pMON 5 0 5. pilf 2 3 7などをあげることができ る。
    [0087] 本発明の植物用のハイブリッド は、 例えば、 Ti プラスミ ド又はそれに由来するプラスミ ドベクターを使用 した場合には、 ァグロパクテリ ゥム · ッメファシエンスに、 三親交雑法、 二親交雑による自律可動性ベクターの直接転 移により、 あるいは直接的な取り込み法、 そのハイブリツ ド を含有する他の細胞とのスフエロプラスト融合に より、 リボゾーム法、 あるい【まウィルスにパッケージとし ての感染によるなどにより、 導入し、 ついで、 このァグロ ノヽクテリ ゥム、 ッメフ了シエンスを植物細胞に感染させる とによって植物細胞を形質転換させうる。
    [0088] さらにまた プラスミ ド又はそれに由来するプラスミ ドベクターを用いた場合にはァグロパクテリウム · リゾゲ ネスが、 上記ァグロパクテリゥム · ッメファシエンスと同 様にして使用される。
    [0089] これら、 ァグ oパクテリゥム細菌を植物細胞に感染させ るには、 当業者に広く用いられている方法が利用できる。 このような方法としては、 例えば、 培養中の植物細胞また. は植物組織中にそのァグロパクテリゥム細菌を加えて更に 培養を続けるか、 栽培中の植物に直接感染させるか、 植物 プロ トプラストにその細菌を直接感染させるか、 植物プロ トプラストとその細菌のスフエロフラストとを融合させる などの方法をとることができる。
    [0090] また、 本発明のハイブリッド ^ は、 直接に植物細胞 または植物組織に導入されて、 それを形質転換させること ができる。
    [0091] このような方法としては、 様々の公知方法が使用でき、 例えば植物のプロトプラストをポリエチレングリコール等 の存在下キヤリァ一 と共に細胞に取り込ませる方法， ホスファチジノレセリンとコレステ口一ノレ力らなるリポソ一 ムの中にハイブリッド^ ^ を入れ、 それでもって植物プ 口 トプラストをボリエチレングリコール等の存在下髙
    [0092] -髙カリシゥム溶液で処理する方法、 マイクロインジェク シン法、 電気パルス法等があげられる。
    [0093] こう して形質転換された植物細胞又は植物組織は、 当業 者によく知られた方法で再生させて植物体とすることがで きる。 このような植物体は、 野外においてもあるいは温室 内においても栽培することができる。
    [0094] 以上説明したことからも解るように、 本発明はォドン ト グロッサム リ ングスポッ ト ウィルスの遣伝子に対応す 'る/ 又はその断片、 あるいはそれらの相補鎖を含有す る遺伝子組換えべクタ一で形質転換された形質転換体及び その作成法にも関するものであることは明らかである。
    [0095] 本発明は、 さらにォドントグロッサム リ ングスボット ウィルスの A TV 遣伝子に対応する 及びその断片、 並びにそれらの相補鎖^ のいすれかを用いたハイプリ ダイゼーシヨン法にも関する。 本発明は、 また特に第 1図 て示される塩基配列の任意の一部ある 、は全部の 鎖 のいすれかを用いたハイプリダイゼーシヨン法にも関する, このハイブリダイゼーションは、 種々の公知の手法で行な うことができるこのハイブリダイゼーシヨン t 、 例えば次 のような条件下に行なうことができる。 すなわち、 被験ウィルス をニ ト ロセルロースフィ ルターに固定した後、 緩衝液、 例えば、 25 M KPO^
    [0096] C pE 7.4 ) 5 x 55 C ¾ 5 X Ve hardt 溶液（この
    [0097] Deuhardt 溶液は 0.2 $ &フィコール（分子量 40, 000 )、 0.2 ボリ ビニルピロ リ ドン（分子量 30,00 0〜
    [0098] 4 0,000 )及び 0.2 ゥシ血清アルブミン（画分 V )力 らなる。 ：)、 5 O^Z^サケ精子/; ¾ 及び 5 0 ホル ムアミ ド液からなる緩衝液中て、 3 7°C〜4 2°Cにて 3時 間から一夜の間プレハイブリダイゼーションを行なう。
    [0099] 次に以上のように処理された二 ト 口セル口ースフィルタ 一を本発明により得られたウイルス遣伝子に対応する の一部の配列からなる プローブを含有する緩衝液、 例えば 25 TO^ ^尸 ( ρ 7.4 )、 5 X 55 5 X
    [0100] Deuhardt 50 ^Z サケ精子 、 5 0 %ホ ルムアミ ド液、 及び 1 0 %デキストラン硫酸塩液からなる 緩衝液中で、 3 7 。C〜 4 2 °Cにおいて 6 時間から一夜ハ イ ブ リ ダイ ゼーシ ョ ン反応を行ない、 次にハイ ブ リ ダイ ズし た ウ ィ ルス D N A を常法に従っ て検出する。
    [0101] なお、 本発明 において用 いられ、 そ して遺伝子組換技 術における一般的な方法及び当業者に と っ て常法である よ う な方法の詳 しい説明は、 例えば、 T. Manniatis et al 「 Molecular Coning - A Laboratory anual J Cold Spring Harbor Laboratory ( 1982 ) ； R. Wu, ed. 「 Method in EnzymologyJ 6 8 (1979)、 1 0 0 (1983)、 及び 1 0 1 (1983) Academic Press 等を参'照する こ と に よ り 容易に理解 し う る。
    [0102] 発明を実施するための最良の形態
    [0103] 以下実施例 を挙げて本発明を更に具体的 に説明す る が、 本発明は これら実施例に限定される ものではない。 実 施 例 1. ウ ィ ルス R N Aの分離 新たな兩紙 液体望素で凍結したシンビジゥムの才ドントグロッサム リ ングスポッ ト ウィルス感染の病葉をよく粉砕し、 次に
    [0104] 0.1 %チォグリコールを含む 2^ 7.0のリ ン酜塩含有緩衝 液を加えて懸濁し、 次にガーゼを通して濾過する。 次に濾 液を四塩化炭素で処理した後、 6 のポリエチレングリコ 一ノレ 6 0 0 0、 0.1 ^ NaC &、 1 % Tri ton X - 1 0 0 となるように各試薬を加え、 氷上にて 2時間静置した。 次にこの溶液を低速遠心（ 3 0 0 0 rpw、 1 5分間、 4 。C、 ： Γひ^ F - S 2 0 ^ ) して、 ウィルス粒子を含む 成分を回収する。 次にリン酸塩含有緩衝液を加えて懸濁し、 髙速遠心処理（ 3 0,0 0 0 rpm、 1時間、 4。C、 - B EC KM AN L S -7 0M . 7 0 . l Ti ro tor ) して、 ウィルス粒子を沈殿として回収した。 次に得られた ウィルス粒子をさらに 1 0〜4 0 のショ糖密度勾配遠心 ( 2 5,7 0 0 rPm、 2時間、 4。C、 B EC KM AN Sl^ 4 0 Ti)にかけ、 遠心チューブの底部より分画分取 する操作を施こしウィルスを純化した。 このようにして純 化したウィルス粒子より常法に従って 5' -フエノール 法により ウィルス を抽出した。
    [0105] 実 施 例 2. ウィルス からの c の合成 実施例 1のようにして得られた精製ウイルス RN Λ(0 末端に、 尸 oiy )ポリメラーゼを用いて Poiy )を 付 加した。
    [0106] 次にオリゴ d (ァ）をプライマーに用い 逆転写酵素 を用いて通常の方法に従って処理し、 ウィルス に相 補的な第一鎖目の ^^^[を合成した
    [0107] 上記オリゴ d COプライマーの代わりに、 ォドントグロ ッサム リ ングスボッ ト ウィルスの塩基配列から合成プ ライマーを作成して用いることもできる。
    [0108] 次にこのようにして得られたウイルス RN A— UN Aか らなるハイブリッド核酸に を作用させ、 その 鎖にニックを入れ、 次にこの^ をプライマ一と して、 ボリメラーゼ Iを用い第一鎖の に相補 的な第二鎖目の の合成を行なった。 ^にクレノウフ ラグメントを作用させてォ一パーハングを除去して、
    [0109] c ^ V の両端を平滑末端とした。
    [0110] 上記処理を行なうにあたっては、 アマシャム · ジャパン、 フアルマシア、 コスモ ·バイオ、 生化学工業、 第一化学薬 品、 宝酒造、 和光純桨などから市販されている各植キット 及びそれらの試薬を利用して行なうことができる。
    [0111] 実 施 例 3. ウ ス c ϋ Ν Aのクローユング
    [0112] 実施例 2で調製された を常法に従ってァ 4 DNA リガーゼで処理して、 その両末端部に ^c o Iアダプタ一 を取りつけた。
    [0113] この は常法に従って樘々のベクターに組み込んで クロ一ニングすることができるが、 ここでは大腸菌プラス ミ ド pひ C 1 1 8を用いてクローニングする場合を例にと つて説明する。
    [0114] ' 上記したようにして実施例 2で調製された^ の両末 端に £coH Iアダプターを付加された は、 次にボリ ヌクレオチドキナーゼを用いて常法に従ってその co I アダプタ一部のリ ン酸化を行なった。 別に、 プラスミ ド pひ C 1 1 8を制限酵素^ c o Iで 3 7。C、 2時間処理し て開裂した。 この線状化した： ひ C 1 1 8をフエノール処 理して、 そこに含まれる制限酵素を不活性化した後、 常法 に従ってアル力リ フォスファターゼで処理して脱リン酸化 した。
    [0115] 上記 2種類の £> ^はエタノール沈殿を施して回収され た後、 それぞれライゲーシヨン緩衝液〔 6 6 Tris -tiCe ( p 7.6 )、 6.6 m MgC 、 1 OmM DTT、 0.1 τηΜ TP〕に溶解された。 次にこれらの溶液を混合 し、 更にその混合溶液中に T 4 リガーゼを加えて、
    [0116] 1 6 °Cて 2時間反応させ、 常法に従ってライゲ一シヨン反 応を行なった。 次にこの反応液を用い、 常法に従って塩化 カルシウム法によってコンビテントな状態にされている大 腸菌 ·/ M 1 09の形質転換を行なった。 次に形質転換され た大腸菌ゾ 1 09は、 培地中でアンピシリン耐性で且つ ac-Z遣伝子の発現しないことを指標に選択されて、 最 終的に ρひ C 1 18の co I切断部位にォドントグロッ サム リングスポッ ト ウィルスの遣伝子に対応する 1)^4 またはその断片の挿入されたプラスミ ドを保持する大腸菌 コ口-一を得た。 このようにして得られた大腸菌コ口-一 から四つのコロニーを選び、 それぞれォドントグロッサム リングスポッ ト ウィルスの遺伝子に対応する^ また はその断片の挿入されているプラスミ ドを得た。 これらの プラスミ ドは、 それぞれ？） O R E 5 - 2 5, p O R E 6 - 4 5、 1 0 3 3及び？） <S 2 4と命名された。 各プラスミ ドのコード領域は図 2に模式的に示してある。
    [0117] なお上記処理を行なうには、 実施例 2て記載したように 市販されている各種キット及び試藥を用いて行なうことが できる。
    [0118] 実 施 例 4. ウィルス c の塩基配列の決定 実施例 3で得られたプラスミ ドを用いて、 図 2のシーケ ンスストラテジーに示した戦略で、 ^ の塩基配列を決 疋した o
    [0119] 適当な制限酵素で断片化し、 次に塩基配列を決定しよう とする ^[断片を、 ゾ《Aiessi7¾f e ί αί ·が開発したlfl3 ファージベクターあるいは pひ C 1 1 8/ 1 1 9プラスミ ドベクターでもってクローニングし、 F.Sanger e t ai ·が開発したいわゆるジデォキシ法（蛋白晳核酸酵 素 0 29 , ¾4 , ) 29 4〜306 ( ；1 9 8 4 ) )を適 用してその塩基配列を決定した。
    [0120] 図 2に示されているように^ co I、 Acc 尸 sil、 Hind ΙΠ、 Mlu Xba I、 Eco R VRXJ^Apa I のそ れそれの部位から塩基配列が解析てきるように 118 及び pひ C 1 1 9のそれぞれのクローニング部位に各^^ 断片を挿入することがなされるが、 適当な大きさに断片化 できない場合には ^ JcowttC I ease Πί 〔ェキンヌクレアー ゼ HI )によるデリーシヨン処理を施こし、 適当な各種の長 さの断片としてから、 その塩基配列を決定した。
    [0121] 上記の方法により決定されたォドン トグロッサム リ ン ダスポット ウィルス遣伝子に対応する^ の塩基配列 を図 1に示す。
    [0122] 図 1に示された 塩基配列は才ドントグロッサム リングスボット ウィルス遺伝子の全鎖長に相当するもの ではないが、 そのうちには該ゥィルスの 3 3 タンパク質 に相当する ϋ域及び外被（コート ）タンパク質に相当する 領域が含まれている。
    [0123] 図 1に示された配列のうち、 上段の配列は該ゥィルスゲ ノムの +鎖 に対応する c 2) である。 図 1に示さ れた塩基配列のうち、 第 5 1 0 7番目の塩基から第 5 5 8 3 番目までの塩基の領域を発現させると、 ウィルスの外被タ ンパク質活性を有する発現物が得られる。 なお図 1中二本 鎖の上段は 5し末端から 3 末端方向への配列で示されて おり、 下段には上段に対して相補的な配列が左側 3 末端 より 5' -末端方向に示されている。
    [0124] 実 施 例 5. ウィルスタンパク質の発現
    [0125] 以下の実施例では図 1で示される塩基配列より、 ウィル スタンパク質をコードする遣伝子部分を分離し、 次にその 遺伝子から発現用ベクターを構築し、 ついでこうして得ら れたベクターをもつて形質転換した宿主細胞により産生さ れたタンパク質が、 ウィルスタンパク質であることを確認 した。
    [0126] (U ゥィルス外被タンパク質遺伝子の単離
    [0127] 図 1の塩基配列よりオープンリ一ディソグフレーム（転 写翻訳枠 '· o u )の探索を行なった。
    [0128] 次に探索された の内で、 タパコモザイクウィルス ( r l/ )の遺伝子構造と比較検討して、 Γ Λί の外被タ ンパク質遺伝子の位置と同等の位置関係を示すと共にほほ 同等量の分子量をコードすることができる 即ち図
    [0129] 1で示される塩基配列の第 5 1 0 7塩基目から第 5 5 8 3 塩基目までを、 ォドントグロッサム リングスポット ゥ ィルスの外被タンパク質をコードする遣伝子部位と推定し た。
    [0130] 次に該 断片を制限酵素て切り出した。 先ず外被タ ンパク質をコードすることが推定される逍伝子部分を tr
    [0131] ^ 断片 * 例えば P ' 5— 25、 p 0 ii' 1 0 3 3 又は p 6— 4 5を制限酵素 X6 I C 4 9 5 0塩基目:) '及び Wsil ( 5 6 3 9塩基目 ）を用いて実施例 3に記載し たような通常の方法に従って処理して、 — Wsil断 片を取得した。 この Χ&αΙ— "I断片を使用し、 図 3に 示すようにして発現用ベクターを構築した。 この ひ I一 Ns i I断片を実施例 3に記載したような通常の方法に従つ て、 プラスミ ドベクター 3 ひ C 1 1 9 (OXb 及び Ps tl 部位に結合した。 こうして得られたハイブリッド を 実施例 3に記載したような通常の方法に従って大腸菌ゾ M
    [0132] 1 09に導入してサブクロー-ングして、 そして形質転換 された大腸菌コ口ニーを選択した。
    [0133] こうして得られた形質転換された大腸菌コロニーからサ ブクローン化した目的ハイプリッド！) プラスミ ドを回 収した。 次にこのプラスミ ドを実施例 3に記載されている ように常法に従って制限酵素 及ひ で処理して、 線状のものとし、 次にェキソヌクレアーゼ ΠΙで通常の方法 に従ってデリーシヨンを行なった。 ウィルス外被タンパク 質をコードする遣伝子の の翻訳開始部位 ァ Gコド ンの 4塩基手前まで、 このデリーシヨンを行なう。 次にこ W 側平滑末端に通常の方法を用いて^ coi I リ ンカ一 を取りつけた。 次に制限酵素 dillでもって通常の方法 で処理して、 ウィルス外被タンパク質をコードする遺伝子 の を含有する co I一 tiind M断片を取得した。
    [0134] 12) ウィルス外被タンパク質遺伝子の発現
    [0135] 上記工程 (1)で得られたウイルス外被タンパク質遣伝子を コードする Z) を含む 断片を、 大腸菌用発現べク タ一φΚΚ 223— 3の i'co I及び EI部位に、 実 施例 3に記載されているような通常の方法に従って結合し た。 次にこのハイブリッド ^ を用い、 実施例 3に記載 されているような通常の方法に従ってコンビテントな大腸 菌ゾ l 09を形質転換し、 大腸菌での発現を行なった。 このようにして形質転換された大腸菌は、 先ずアンピシリ ン 50 # を含む 培地 ： 5 ）て一夜培養を行な い、 次にその培養液から 5 0 を分取し、 新鮮培地〔2X T y'¾¾ C 5m ） 〕で培養（ 37°C、 2.5時間） した。 次 にその培地に l O O IPTG 5 添加（終滠度 0. l i)して後、 さらに培養を 4 (TCで 1.5時間行なつ た。
    [0136] こうして得られた培養液を 5分間氷冷した後、 その 2 の培養液より大腸菌を常法に従って集め、 次いで？' 緩衝 液で洗狰後、 1 00 * の ΛΓα 尸 04 C ρΒ 7.0 )液に懸濁 した。 この懸濁液を超音波破砕（ 1分間印加、 30秒間停 止の処理を 6回繰り返す）にかけ、 大腸菌よりタンパク質 の抽出を行なった o
    [0137] こうして得られた抽出液を 1 5 5' £) 5ポリアクリルァ ミ ド電気泳動にかけた後、 ゲル上のタンパク質を二トロセ ノレロースフィルターにエレクトロブロットする。 ォドント グロッサム リングスポッ ト ウィルスに対する抗血清を 用いて、 公知の方法に従ってィ ミユンブロットアツセィ (ウェスタンブロット法）にかけ、 ニ ト ロセルロースフィ ルター上にそのォドントグロッサム リングスポッ ト ゥ ィルスに対する抗血清と反応するタンパク質があるか否か を検ベた。 図 3に示すように、 上記のようにして形質転換 された大腸菌 1 0 9 φ θ R C P - D 8 3と命名し ） から抽出されたタンパク質は、 ォドントグロッサム リン グスポッ ト ウィルスに対する抗血清と反応した。 この抽 出されたタンパク質はォドントグロッサム リングスポッ ト ウイルスの外被タンパク質であることが確認された。 こ こ で得 られた上記形質転換大腸菌 J M 1 0 9 株 ( P 0 R C P — D 8 3 と命名） は工業技術院微生物工業 技術研究所 に平成元年 1 1 月 2 7 日 に 微ェ研条寄第 1 1 1 3 4号 [ F E R M P — 1 1 1 3 4 ] と して寄託 されて いる。
    [0138] (3) 同様な手法を繰 り 返す こ と によ り 、 ウ ィ ルスの 3 3 K タ ンノ ク質を取得する こ と もでき る。
    [0139] 図 面 の 簡 単 な 説 明
    [0140] 図 1 は、 ォ ド ン 卜 グロ ッ サム リ ン グスポ ッ ト ウ イ ルス遺伝子に対応する D N Aの塩基配列を示す。 上段の 塩基の配列が ゥ ィ ルス ゲ ノ ム の +鎖 R N A に対応する c D N Aの塩基配列.を示すものである。
    [0141] 図 2 は、 図 1 に示された D N Aの塩基配列を決定する ための戦略 と 、 それに使用 された主な制限酵素の切断部 位を示す。 各 D N A断片は矢印の方向にその塩基配列が 決定された。 新たな用紙 - 図 3は、 ォドントグロッサム リングスポッ ト ウィル スの外被タンパク質遣伝子発現用べクタ一の構築法を模式 的に示す。
    [0142] 図 4は、 遣伝子組換えで得られたォドントグロッサム リングスポット ウイルスの外被タンパク質を同定するの に用いられたィ ミユンブロットアツセィ試験の結果を示す ものである。
    [0143] レーン はォドントグロッサム リングスポッ ト ウイ ルス粒子、 レーン^は大腸菌 ^ 1 09から抽出された タンパク質、 レーン Cは実施例 5て得られた形質転換大 腸 ®H l 09 C p ORC P-D 8 3と命名：）から抽出 されたタンパク質をそれぞれ示す。
    权利要求:
    Claims請 求 の 範 囲
    1. ォ ド ン ト グロ ッ サム リ ン グス ポ ッ ト ウ ィ ル ス ( Odontoglossum ringspot virus ； 0 R S V ) の + に対応する D N A及びその断片、 並びにそれらの相補鎖 D N A。
    2 次の塩基配列 ：
    10 20 30 40
    5' GACTGTTCTT ACTCCGTTGA TCTTCCGGGA AAAACATACG 3' CTGACAAGAA TGAGGCAACT AGAAGGCCCT TTTTGTATGC
    50 60 70 80
    CTGTGGCGCT TCATAGTATC TATGATATTC CAGCGGATGA GACACCGCGA AGTATCATAG ATACTATAAG GTCGCCTACT
    90 100 110 120
    GTTCGGAGCT GCCTTATTAC GAAAGGATGT TCACATATGT CAAGCCTCGA CGGAATAATG CTTTCCTACA AGTGTATACA
    130 140 150 160
    TATGCTGCTT TTCATTTTAG TGAGAATCTG CTTCTTGAGA ATACGACGAA AAGTAAAATC ACTCTTAGAC GAAGAACTCT
    170 180 190 200
    CTACGTCTGC TCCGCTCGAT GAGATTGGAG CGACGTTTTA GATGCAGACG AGGCGAGCTA CTCTAACCTC GCTGCAAAAT
    210 220 230 240
    CAAGTCAGGG GATAGATTAT CCTTCTTCTT TCAAAATGAG GTTCAGTCCC CTATCTAATA GGAAGAAGAA AGTTTTACTC
    250 260 270 280
    AGCACATTGA ATTATGAACA TTCTTATAAA AACGTAATTA TCGTGTAACT TAATACTTGT AAGAATATTT TTGCATTAAT
    290 300 310 320
    AATATGTTTG CAAGACTTTT TTCCCAGCTT CAAATAGGTT TTATACAAAC GTTCTGAAAA AA^GGTCGAA GTTTATCCAA
    330 340 350 360
    CGTCTACCAT AAGGAATTTA TGTGCAGCAG AGTTAACACA GCAGATGGTA TTCCTTAAAT ACACGTGGTC TCAATTGTGT 新たな用紙
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    160 2212150 214030 TTTAAATATTACG ACHA T1GT ACCAAGCAA GATAACTTGC- A1AAAA AACTTGGA CTTAATGCAT TAGCCTG TTTCGTT- AGCAA CTCTT AGACCTGTA ATTCTCGCTTTCCTTTA1CG T
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    5650 5660 5670 5680
    GCATAGTGGT TATCCCTCCA CTTAAATCGA AGGGTTTTTC CGTATCACCA ATAGGGAGGT GAATTTAGCT TCCCAAAAAG
    5690 5700 5710 5720
    ACTGCAGATA TGTAGGTTTC CTACGGTGAA TATAAAACTT TGACGTCTAT ACATCCAAAG GATGCCACTT ATATTTTGAA
    5730 5740 5750 5760
    ATATCCCGTT GTGTA.CACGA TAGTACATAG TGTTTATCCC TATAGGGCAA CACATGTGCT ATCATGTATC ACAAATAGGG
    5770 5780 5790 5800
    TCCACTTAAA TCGAAGGGTT TTGTGTCAGA CGCGTGTAAG AGGTGAATTT AGCTTCCCAA AACACAGTCT GCGCACATTC
    5810 5820 5830 5840
    GAGTGGTCAA CCTTACGACA CATTTAAAAT AATGCGTCCG CTCACCAGTT GGAATGCTGT GTAAATTTTA TTACGCAGGC
    5850 5860 5870 5880
    TGGTGCATAC GATAATGCAT AGTGTTTGTC CCTCCACTTA ACCACGTATG CTATTACGTA TCACAAACAG GGAGGTGAAT
    5890 5900 5910 5920
    AATCGAAGGG TTGTGTATAT GGATCATGCG GATAAAGTTA TTAGCTTCCC AACACATATA CCTAGTACGC CTATTTCAAT
    5930 5940 5950 5960
    TACTGGTGCA GTATAACCCG TTATACACAT AAAATTATGA ATGACCACGT CATATTGGGC AATATGTGTA TTTTAATACT
    5970 5980 5990
    GGGATTCGAA TTCCCCCTTA CCTCGGGTAG AGGCCCA 3' CCCTAAGCTT AAGGGGGAAT GGAGCCCATC TCCGGGT 5' で表される二本鎖 D N Aの う ちの任意の一部あるいは全 部を含有する ものである請求項 1 に記載の D N A及びそ の断片、 並びにそれらの相補鎖 D N A。
    3. 請求項 2 に記載の D N A鎖のいずれかと ハイ プ リ ダ ィ ズする こ とができ'、 その塩基配列 と は部分的に異なる 新たな用紙 塩基配列を有 しかつォ ド ン ト グロ ッ サム リ ングスポ ッ ト ウ ィ ルスの遺伝子 と し ての性質を持つものである請 求項 1 に記載の D N A及びその断片、 並びにそれらの相 補鎖 D N A 0
    4. 請求項 1 に記載の二本鎖 D N Aから、 制限酵素 Eco R I 、 Acc I 、 Pst I 、 Hind Π 、 M lu I 、 Xba I 、 Eco R V及び Apa I の う ちの一種ある いは二種以上 の制限酵素に よ る 開裂に よ り 生ずる 請求項 2 に記載の D N A及びその断片、 並びにそれらの相補鎖 D N A。
    5. ォ ド ン 卜 グロ ッ サム リ ン グスポ ッ ト ウ ィ ルスの R N A遺伝子を単離する工程、 その単離された R N Aよ り その R N Aに相補的な c D N Aを製造する工程よ り な る こ と を特徴 と する 請求項 1 〜 4 の いずれかに記載の D N A及び断片、 並びにそれらの相補鎖 D N Aを製造す る方法。
    6. 得 られた c D N Aをさ ら にク ローニ ン グする こ と 力 ら なる請求項 5 に記載の方法。
    7. ォ ド ン ト グロ ヅ サム リ ングスポ ッ ト ウ ィ ルスの 遺伝子に対応する D N A又はその断片、 ある いはそれら の相補鎖 D N Aを組み込んでなる遣伝子組換えべ ク タ
    ' o
    8. 請求項 2〜 4のいずれかに記載の D N A又はその断 片、 ある いはそれらの相補鎖 D N Aを組み込んでなる請 求項 7 に記載の遺伝子組換えベク ター。
    9. ォ ド ン ト グロ ッ サム リ ングスポ ッ ト ウ ィ ルスの 新たな用 遣伝子に対応する D N A又はその断片、 ある いはそれ ら の相補鎖 D N Aを含有する遺伝子組換えベク ターで、 形. 質転換された形質転換体。
    10. 請求項 8 に記載の遺伝子組換えベク ターで、 形質転 換された ものである請求項 9 に記載の形質転換体。
    11. 宿主細胞が大腸菌、 枯草菌、 酵母ァグロパクテ リ ウ ム属菌、 植物細胞である請求項 9 または 1 0 に記載の形 質転換体。
    12. ォ ド ン ト グロ ヅ サム リ ングスポ ッ ト ウ ィ ルスの 遺伝子に対応する D N A又はその断片、 ある いはそれら の相補鎮 D N A を組み込んでなる遺伝子組換えベク ター でも っ て宿主細胞を形質転換させる こ と よ り なる形質転 換体の製造法。
    13. 請求項 8 に記載の遺伝子組換えベク ターを用いる こ とから なる請求項 1 2 に記載の方法。
    14. ォ ド ン ト グロ ッ サム リ ングスポ ッ ト ウ ィ ルスの R N A遺伝子、 ある いはその R N A遺伝子を逆転写して 得られた c D N A、 ある いはさ ら にはその c D N Aをク ローニ ン グして得られた核酸を、 請求項 1 〜 4 のいずれ かに記載の D N A及びその断片、 並びにそれらの相補鎮 から選ばれた ものからなるブローブとのハイ ブ リ ダィ ゼ ー シ ョ ンによ っ て検知する こ と を特徴 とするォ ド ン ト グ ロ ッ サム リ ン グスポ ッ ト ウ ィ ルス関連遺伝子の分析 法。
    15. 遣伝子組換え技術によ り製造されたォ ド ン ト グロ ッ 新たな用紙 . サム リ ン グスポ ッ ト ウ ィ ルスの 3 3 Κ タ ンパク質又 はその外被夕 ンパク質ある いはそれらのぺプチ ド断片化 合物。
    新たな用紙
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    DE69014100D1|1994-12-15|
    JPH04144685A|1992-05-19|
    DE69014100T2|1995-06-14|
    EP0460217A1|1991-12-11|
    EP0460217A4|1993-02-17|
    EP0460217B1|1994-11-09|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1991-06-13| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): US |
    1991-06-13| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IT LU NL SE |
    1991-07-29| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1990917547 Country of ref document: EP |
    1991-12-11| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1990917547 Country of ref document: EP |
    1994-11-09| WWG| Wipo information: grant in national office|Ref document number: 1990917547 Country of ref document: EP |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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